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Reportagem

Bom para os animais, bom para nós

Diminuir o sofrimento animal pode gerar testes de segurança mais rigorosos.

Alan M. Goldberg e Thomas Hartung
Cary Wolinsky
Em 1999, um coelho de 2 metros de altura, com orelhas caídas e olhos tristes,acompanhou o candidato à presidência dos Estados Unidos Al Gore durante toda a campanha eleitoral. O crime de Gore: como vice-presidente, ele havia iniciado um programa de testes de toxicidade química que causaria o sofrimento ou a morte de quase 1 milhão de animais. Para muitos, no entanto, o programa parecia absolutamente necessário.

Dois anos antes, o grupo Defesa Ambiental divulgara a existência de dados sobre a segurança de apenas 25% das 100 mil substâncias químicas usadas, informação que a Agência de Proteção Ambiental (EPA) e o Conselho Americano de Química confirmaram. Gore havia reunido ativistas ambientais, reguladores e fabricantes a fim de iniciar um programa para avaliar a segurança mínima de 2.800 substâncias produzidas ou importadas pelos Estados Unidos em quantidades de até 500 mil toneladas. Um web site divulgaria os resultados obtidos.

O coelho gigante enfatizava uma verdade: a cada ano, milhões de animais são sacrificados em testes de toxicidade, e novos programas poderiam aumentar esse número. A EPA listou cerca de 80 mil substâncias cujos dados básicos de segurança deveriam ser obtidos com prioridade; além disso, sua ambiciosa Iniciativa de Saúde das Crianças busca examinar fenômenos como os efeitos de longo prazo da exposição do feto a produtos químicos. Outro projeto da agência é estudar as conseqüências neurológicas de chumbo, mercúrio e outros venenos para a reprodução e o desenvolvimento.

Do outro lado do Atlântico, o programa para Registro, Avaliação e Autorização de Substâncias Químicas (Reach) avaliará a segurança de 30 mil substâncias produzidas ou comercializadas na Europa. Em 2001, o Conselho de Pesquisa Médica do Reino Unido calculou que esse programa exigirá US$ 11,5 bilhões, 40 anos e mais de 13 milhões de animais. No total, os programas existentes estimam empregar centenas de milhões de animais e dezenas de bilhões de dólares apenas para determinar a segurança das substâncias. E todos os anos, a indústria acrescenta milhares de novas substâncias a essa lista.

Os autores deste artigo pertencem a uma pequena comunidade de cientistas espalhada por indústrias, universidades e governo que há décadas procura resolver o conflito entre segurança e humanidade. O programa de Gore nos deu a chance de mostrar nossas propostas. A pedido da Defesa Ambiental, um de nós (Goldberg) reuniu cientistas das universidades Johns Hopkins, Carnegie Mellon e Pittsburgh para investigar como o programa poderia atingir seus objetivos com número menor de animais.
O programa deveria coletar uma quantidade mínima de dados denominada Screening information data set, o que a Organização para a Cooperação e o Desenvolvimento Econômico (OCDE) recomenda para avaliar o risco de um produto químico. Neste programa, 430 animais seriam necessários para cada produto analisado. Felizmente, a OCDE, que padroniza as normas científicas de 30 países, incluindo os Estados Unidos, aceita protocolos inovadores para testes que exigem menos animais. Usando as diretrizes da organização e reformulando alguns protocolos para extrair múltiplos resultados de testes simples, demonstramos que o número de animais poderia ser reduzido em cerca de 80% - para 86 animais - sem perda de dados.

Acusada pelos defensores dos animais de ser uma apologia da pesquisa animal e ridicularizada pelos cientistas por ser sentimentalista, a ciência que busca alternativas para os testes de toxicidade ainda assim trilha o caminho onde o bem-estar dos bichos e o rigor científico se encontram. Esse campo está mudando o modo como substâncias químicas e produtos biológicos são produzidos e testados.

Redução, Refinamento e Substituição
As exigências legais para esses testes variam em todo o mundo. Na União Européia, por exemplo, desde 2003 nenhum cosmético pode ser vendido se o produto final ou qualquer de seus ingredientes tiver sido testado em animais desde que alternativas existam. A abolição dos testes de ingredientes cosméticos em animais deverá entrar em vigor até 2009. Já a FDA, agência americana de controle de alimentos e fármacos, exige apenas que certos dados de segurança estejam disponíveis após sua comercialização. Com o tempo, a FDA desenvolveu diretrizes para lidar com denúncias sobre segurança; entre elas, o controvertido teste de irritação ocular de Draize, que consiste em aplicar uma substância nos olhos de coelhos albinos para avaliar seu efeito.

A EPA e suas equivalentes européias especificam o método para avaliar produtos agroquímicos. O teste de um único pesticida consome no mínimo dois anos e cerca de 10 mil animais de várias espécies. Os cientistas determinam se o produto é absorvido pela pele, se pode ser inalado, se deixa resíduos na colheita ou se pode ser ingerido. Para cada item, várias questões devem ser respondidas para indivíduos - fetos inclusive - de diferentes idades: quanto tempo a pessoa pode ser exposta, que quantidade do produto pode absorver e como ele se distribui no organismo.
Se o produto não entra na corrente sangüínea, os cientistas só se preocupam com os efeitos de sua aplicação tópica. Porém, se o composto é absorvido pelo sangue, seus efeitos e os de seus metabólitos em vários órgãos devem ser verificados. No procedimento-padrão, a substância é ministrada a ratos, camundongos, cães e outros mamíferos durante toda a vida desses animais para observar disfunções, câncer e outras doenças.

Também as crias são acompanhadas por toda a vida. Outros testes podem ser incorporados ou feitos em separado.

Nove empresas multinacionais revelaram a Goldberg que usam placa de Petri ou testes com não-mamíferos, como peixes ou vermes, para determinar se uma substância é segura para ser produzida. Só então realizam estudos de longa duração com mamíferos - para satisfazer seus advogados e as agências reguladoras. A tabela na página ao lado traz a série completa de testes em animais exigida para avaliar a segurança de uma substância ou droga. Agências governamentais de controle exigem testes com animais em parte porque algumas das melhores alternativas são segredos industriais e porque confiam nesse tipo de procedimento, que já protegeu a população no passado.

Só recentemente as agências se mostram mais abertas para considerar alternativas. A idéia data de 1959, quando William Russell e Rex Burch, da Federação das Universidades para o Bem-estar Animal, na Inglaterra, criaram os "três Rs" reduction, refinement and replacement - redução, refinamento e substituição - para minimizar o sofrimento animal inerente a muitos estudos. Talvez não possamos encontrar alternativas para um ou outro R, mas a concepção ainda é muito útil.

Redução significa formular testes para gerar informações adequadas com o menor número possível de animais. Por exemplo, testes para toxicidade sistêmica aguda medem os efeitos, observados por 14 dias, da ingestão de determinada substância uma ou mais vezes em 24 horas. A medida de toxicidade aguda mais aceita é a dose letal 50% ou LD50: quantia necessária para matar metade dos animais em teste. Para definir a dose letal, os técnicos administram quantidades específicas de uma substância a cada animal de um grupo de dez machos e dez fêmeas. Usando seis ou sete grupos, cada um recebendo uma dose diferente, é só contar os mortos.
Os técnicos começaram a ver esse teste como matança e procuraram métodos mais eficientes. Desde 1989, análises estatísticas permitem que uma LD50 seja obtida com 45 animais, e hoje a OCDE aceita um padrão que mede a dose letal com 16 animais em média. Um estudo recém-finalizado promete reduzir esse número para cerca de seis animais por substância.

Em outro caso, técnicas de imagem como raios X, ressonância magnética e tomografia por emissão de pósitrons podem revelar diferenças entre uma vasta série de estados normais e alterados em órgãos dos animais. Essas técnicas permitem acompanhar um único animal durante o teste como alternativa ao método tradicional: tomar um grupo de animais e matar um a cada estágio para, por exemplo, determinar o estado de seu fígado. As imagens proporcionam um melhor controle dos dados e reduzem o uso de animais em até 80%.

Uma técnica futurista, a biofotônica, desenvolvida por Christopher H. Contag e Pamela R. Contag, da Universidade Stanford, ajusta-se com mais precisão à esfera do refinamento: conceber testes que envolvam menos sofrimento animal. Por exemplo, um pesquisador introduz o gene da enzima luciferase numa célula cancerosa e insere-a num animal. A enzima faz com que a célula cancerosa e suas filhas brilhem. Facilmente medidos por instrumentos especializados, os fótons permitem monitorar o crescimento do câncer sob a influência de agentes químicos e farmacêuticos - bem antes de o animal desenvolver um tumor palpável. De fato, o procedimento elimina o sofrimento e pode ser usado para estudar uma grande variedade de doenças em estágios iniciais.

Outra técnica de refinamento, bastante útil em testes de vacina, consiste em fixar um "ponto final mais humano", para que um estudo doloroso termine tão logo dados relevantes sejam coletados. Por exemplo, se a temperatura do corpo de um animal cai abaixo de um limite, jamais será recuperada; o teste pode, então, ser interrompido sem perda de dados e poupar a criatura de morte lenta. Se um animal vacinado contra a raiva e infectado com o vírus começar a girar, é sinal de que a vacina falhou e o animal pode ser humanamente sacrificado, o que o livrará de horas de agonia. Melhor ainda, os técnicos que avaliam a eficácia de vacinas podem checar o nível de anticorpos após a infecção, em vez de esperar que o animal desenvolva sinais da doença. O refinamento também inclui o uso de medicamentos e anestésicos para reduzir a dor.

Além disso, outra classe de refinamento usa espécies de níveis inferiores na escala evolutiva, na crença de que sofrem menos. Tornou-se comum o uso do peixe-zebra (ou paulistinha) e do nematóide Caenorhabditis elegans para observar o desenvolvimento do sistema nervoso sob a influência de substâncias químicas. Nas duas espécies, os cientistas estabeleceram a função dos genes essenciais: se uma substância liga ou desliga um gene, os pesquisadores sabem como a mudança afetará a produção de proteína e o metabolismo celular. Basta mergulhar um grupo de genes em uma substância - um chip de 2,5 por 5 cm contendo, digamos, os 9 mil genes relevantes do peixe-zebra - para saber quais deles são ativados por essa substância.
Recentemente, empresas começaram a produzir chips de genes humanos, incluindo os que, acredita-se, controlam a resposta celular à toxicidade. A tecnologia, que alcançará seu auge no futuro - já que a interpretação da mensagem de um chip ainda é um desafio -, ilustra o mais interessante dos Rs, a substituição (replacement). Aqui, a idéia é abolir absolutamente o uso de animais em testes. A maioria dessas alternativas deve sua existência ao tremendo progresso na criação de tecnologias baratas, rápidas e eficientes, e não aos apelos por um tratamento humanizado. Por exemplo, a maioria das análises de hormônios, como os testes de gravidez, que já envolveu testes de longa duração em animais vivos, é agora realizada por meios alternativos (químicos ou imunológicos).

Um dos primeiros exemplos de substituição foi a descoberta casual, na década de 70, de uma alternativa para o teste de pirogênio, feita por Henry Wagner da Universidade Johns Hopkins. O método verifica a presença de contaminantes bacterianos que causam a febre, injetando uma substância em coelhos e medindo sua temperatura 24 horas depois.

Wagner desenvolvia radioisótopos de meia-vida curta como técnica de diagnóstico por imagem em humanos, e devia assegurar que estavam livres de toxinas bacterianas - mas os radioisótopos estariam inativos no momento em que o teste com os coelhos fornecesse os resultados.

Wagner sabia que Federick Bang, também da Johns Hopkins, havia demonstrado que a hemolinfa (sangue) do caranguejo-ferradura reagia a importantes toxinas bacterianas de maneira previsível e mensurável. A FDA logo autorizou o uso do teste, chamado Limulus amebocyte lysate ou LAL, para detectar pirogênios.

Recentemente, Albrecht Wendel, da Universidade de Konstanz, Alemanha, e um de nós (Hartung) demonstraram que as toxinas bacterianas podem ser detectadas por sua propriedade de induzir os leucócitos do sangue humano a liberar proteínas chamadas citocinas, algumas das quais estimulam o cérebro a gerar a febre. Assim, a simples verificação das citocinas no sangue revela a presença de toxinas relevantes, superando diversas limitações do teste LAL.
Encontrar certas substituições - como para o teste de irritação ocular de Draize, muito doloroso para os coelhos - exige pôr em foco o bem-estar animal. Há uma década, pesquisadores começaram a realizar o teste em globos oculares frescos obtidos em abatedouros, em vez de usar coelhos vivos. Embora incipiente, a alternativa eliminou a dor e o uso de animais extras. Na Alemanha, a fina membrana que separa a gema da clara no ovo de galinha tem servido como substituta para a córnea nesses testes.
Na década de 80, o Centro de Alternativas para Testes em Animais da Johns Hopkins, dirigido por Goldberg, financiou pesquisas para verificar como diferentes substâncias afetam culturas de tecidos bidimensionais de células da córnea humana. Baseadas nesses estudos, várias empresas produzem tecidos tridimensionais, que reproduzem com precisão as superfícies do olho humano - permitindo observar irritações e mudanças estruturais sutis.

Hoje, podemos desenvolver uma grande variedade de células humanas de órgãos como pele, pulmão, olhos, músculo e membranas mucosas. Mais interessante é a reconstituição de tecidos - construções tridimensionais de células especializadas, cultivadas num sistema de suporte. Além do olho, tecidos artificiais são produzidos para pele, pulmão, sistema gastrointestinal e revestimento da boca e da vagina. Amplamente adotados pela indústria, substituem os animais num grande número de testes. (Ainda resta desenvolver culturas tridimensionais para órgãos como o fígado.)

O mais importante é que culturas de células e tecidos possibilitam a observação dos mecanismos biológicos pelos quais uma substância química atua, como nunca foi possível com animais. Podemos hoje produzir in vitro os processos bioquímicos gerados por uma substância. No futuro, esses estudos permitirão prever as conseqüências funcionais - alterações nos genes, mudanças no crescimento celular etc. - da exposição de uma célula, no corpo humano, a uma substância química. Mais ainda, a cultura de múltiplos tecidos numa única câmara, sistema recém-criado pela AP Research, em Baltimore, pode reproduzir interações complexas como a transformação de uma substância em outra pela atividade metabólica de um órgão que, por sua vez, afeta outros órgãos. Esses progressos, embora ainda nos primeiros passos, poderão abolir o uso de animais em estudos de toxicodinâmica: a cadeia de eventos pela qual uma substância é distribuída, metabolizada e excretada.

Talvez as últimas substituições não serão in vitro, mas "in silicium": a indústria farmacêutica começa a usar modelos computadorizados de interação dos sistemas orgânicos para estudar os efeitos de drogas.

Charles DeLisi, da Universidade de Boston, e outros procuram patrocinadores para o Projeto Homem Virtual, uma aplicação da informática distribuída, da escala do Projeto Genoma Humano. Talvez, o homem virtual possa um dia simular a resposta humana a estressores biológicos, físicos e químicos, tornando desnecessários os estudos com animais.
Convencendo os Céticos
Hoje, a descoberta de novas alternativas ainda é um processo incerto. Obter recursos para pesquisas específicas tem sido difícil, ao menos nos Estados Unidos. O Programa Nacional de Toxicologia, que coordena os programas federais de testes toxicológicos e os Institutos Nacionais das Ciências da Saúde Ambiental, fornece grande parte dos fundos para essas pesquisas. Embora as agências americanas desejem uma ciência mais humana, na última década investiram menos de US$ 10 milhões para validar alternativas e regular seu uso. Já a União Européia gastou mais de US$ 300 milhões no mesmo período em métodos alternativos e sua validação, e os países-membros também investiram - só a Alemanha ultrapassou os US$ 100 milhões - na busca de alternativas. (Na verdade, os EUA e a UE gastam muitos milhões de dólares em pesquisas que um dia levarão a essas alternativas.)

A eficácia de uma alternativa deve ser provada para que as agências reguladoras possam aceitá-la. O Comitê de Coordenação Interagências para a Validação de Métodos Alternativos (ICCVAM), formada por representantes de 15 agências federais americanas, designou comissões de especialistas para avaliar a literatura, incluindo os protocolos das empresas, para determinar a validade de um teste. Então, dependendo da sua jurisdição, cada agência decide se aceita o teste. Desde a sua criação em 1977, o Comitê avaliou 16 métodos alternativos, seis dos quais foram adotados, enquanto os demais passam por aperfeiçoamentos. No passado, um teste aprovado poderia levar uma década para ser amplamente adotado, mas com o comitê esse tempo é menor.

Na Europa, a validação de uma alternativa segue a complexidade dos experimentos clínicos. Assim como esses experimentos são "baseados em evidências" e devem demonstrar que uma droga é eficaz, os testes de validação também devem provar que uma alternativa é eficiente. O conceito de validação obteve consenso internacional num seminário da OCDE em Solna, Suécia, em 1996. De acordo com os Princípios de Solna, o Centro Europeu para a Validação de Métodos Alternativos (ECVAM) e também o ICCVAM realizam estudos de "pré-validação" para avaliar o potencial de uma alternativa e eliminar problemas técnicos com o seu protocolo. Na Europa, se o teste passa, o ECVAM seleciona vários laboratórios em diferentes países para submeter uma grande gama de substâncias codificadas ao teste alternativo. Muitas vezes, os laboratórios avaliam muitas alternativas potenciais para um dado teste com animais. Cerca de 35 cientistas, representando os 25 países-membros, a Comissão Européia, as associações acadêmicas, a indústria e os grupos de defesa dos animais, julgam os resultados; o ICCVAM participa como observador. Se uma alternativa for capaz de aferir com precisão a propriedade relevante das substâncias e seus resultados forem consistentes e reproduzíveis em laboratório, o comitê declara formalmente sua validade.

Num recente teste de validação, por exemplo, dez laboratórios passaram três anos estudando seis alternativas para o teste de pirogênio, verificando a sua capacidade para analisar as substâncias causadoras da febre em 190 amostras não identificadas. Cinco testes passaram para a fase de revisão, agora em andamento. Desde a sua fundação em 1991, o ECVAM aprovou 17 alternativas; nove estão no estágio final de revisão; outras 25 passam por análises finais. Pela lei, uma alternativa deve ser usada na Europa quando aprovada, mas na prática a demora de vários anos ainda é comum. À medida que os reguladores se acostumam aos novos métodos, são mais rápidos em aceitá-los.
A busca pela substituição sofreu um grande revés no início dos anos 90, quando seis testes de validação para alternativas ao teste de Draize falharam. O resultado foi embaraçoso, pois algumas delas eram usadas na indústria de cosméticos sem problemas. Após revisar os dados, hoje compreendemos por que falharam: os resultados haviam sido comparados aos do próprio teste de Draize, que produz muitos falsos positivos. O ICCVAM e o ECVAM estão hoje revisando as informações sobre o teste de Draize e suas alternativas. O estudo será a base de uma declaração de validade ou de outro teste de validação de alternativas e, desta vez, confiamos no seu êxito.

Um dia, o coelho de Al Gore desmaiou devido ao calor e foi reanimado pelos assessores do candidato. O incidente sugere uma metáfora oportuna: os supostos inimigos dos animais correm em seu socorro. As pesquisas podem reduzir drasticamente o uso de animais. Acredita-se que as alternativas existentes diminuam em 70% o número de animais para o programa Reach, e é provável que um número próximo a esse seja prioridade da EPA. Em outras palavras, as alternativas podem economizar talvez bilhões de dólares e eliminar décadas de testes - ao mesmo tempo que produzem dados mais rigorosos e pertinentes. A nova ciência será capaz então de proteger melhor não apenas as criaturas que deveria ajudar, mas também a todos nós.

Para conhecer mais

Animals and alternatives in testing: history, science, and ethics. Joanne Zurlo, Deborah Rudacille e Alan M. Goldberg. Mary Ann Liebert, 1994.

Trends in animal research. Madhusree Mukerjee em SCIENTIFIC AMERICAN, vol. 276, no 2, págs. 86-93, fevereiro de 1997.

To 3R Is humane. Alan M. Goldberg e Paul A. Locke em Environmental Forum, págs. 19-26, julho/agosto de 2004.

http://altweb.jhsph.edu (Altweb: alternatives to animal testing)
European center for the validation of alternative methods: http://ecvam.jrc.cec.eu.int/index.htm