Reportagem
edição 72 - Maio 2008
Perspectivas para a regeneração de membros humanos
O progresso rumo à regeneração de partes importantes do organismo, como acontece com a salamandra, pode revolucionar o tratamento de amputações e de ferimentos graves
por Ken Muneoka, Manjong Han e David M. Gardiner
AARON GOODMAN
Os membros de uma salamandra são menores e mais delgados que os da maioria de nós, humanos, mas as diferenças acabam aí. As patas e a cauda da salamandra são recobertas por pele e constituídas por esqueleto ósseo, músculos, ligamentos, tendões, nervos e vasos sangüíneos. Um arranjo frouxo de células chamadas fibroblastos garante unidade a esses tecidos internos e forma aos membros. Mas um aspecto torna os membros da salamandra únicos entre os vertebrados: a capacidade de regenerar-se a partir de um coto depois de amputado. Dessa forma uma salamandra adulta consegue regenerar completamente uma mão ou um pé, vez após vez, sejam tantas quantas forem as amputações. Os sapos conseguem regenerar um membro durante a metamorfose do girino, quando do primeiro surgimento de seus membros; mas perdem essa faculdade na vida adulta.

Mesmo os embriões de mamíferos estão aptos a substituir membros em desenvolvimento, mas essa faculdade igualmente desaparece muito antes do seu nascimento. De fato essa perda da capacidade regenerativa ao longo do desenvolvimento do organismo tende a se repetir na evolução de formas animais superiores, fazendo da lenta salamandra o único vertebrado que continua capaz de reproduzir partes complexas do corpo durante toda a vida.

Há muito os humanos questionam como o animal consegue esse feito. Como pode a parte do membro regenerada “saber” o quanto lhe falta a ser restituído? Por que a pele no coto não cicatriza fechando a ferida como acontece nos humanos? Como o tecido na salamandra adulta retém o potencial embrionário para reconstruir um membro inteiro do zero diversas vezes? Os biólogos estão perto de responder a todas essas perguntas. E, ao se entender como o processo regenerativo funciona na Natureza, espera-se conseguir desencadeá-lo para reconstituir membros amputados em humanos, por exemplo, e revolucionar a recuperação de outras graves feridas.
KEN MUNEOKA
A PATA DO CAMUNDONGO produz um fator de crescimento chamado BMP4 (mancha púrpura) durante o desenvolvimento fetal dos dedos, igualmente importante na regeneração natural das extremidades dos dedos nesses mesmos animais.
A resposta inicial do corpo humano a um ferimento grave não é muito diferente do que ocorre com uma salamandra, mas, logo a seguir, as estratégias de cura de uma ferida nos humanos e nos anfíbios difere bastante. A nossa resulta numa cicatriz e evolui para a falta de resposta quanto à regeneração; contudo, diversos sinais indicam que humanos têm o potencial para reconstruir partes complexas. A chave para que isso aconteça talvez seja explorar as nossas capacidades latentes, de forma que nossa própria cicatrização se pareça mais com a da salamandra. Por essa razão nossa pesquisa se concentrou primeiramente em especialistas, para descobrir como isso de dá.

Aprendendo com a Salamandra

Quando um membro pequenino da salamandra sofre uma amputação, os vasos sangüíneos no coto remanescente prontamente se contraem, reduzindo o sangramento ao mínimo, e uma camada de células epiteliais rapidamente recobre a superfície do local da amputação. Nos primeiros dias após o ferimento essa repidermização se transforma em uma camada de células sinalizadoras, chamadas capa epitelial apical (AEC, na sigla em inglês), que é indispensável para o sucesso da regeneração. Enquanto isso os fibroblastos são dispensados da função de sustentação do tecido conjuntivo e atravessam a superfície amputada até o centro da ferida, onde proliferam para formar um blastema – agregado de células semelhantes a células-tronco que atuarão como pro genitoras do novo membro. Muitos anos atrás pesquisas realizadas no laboratório de Susan Bryant, da University of California em Irvine, mostraram que as células no blastema equivalem às células dos brotos de membros em desenvolvimento de um embrião de salamandra. Essa descoberta indica que a reconstrução de um membro pelo blastema é essencialmente uma recapitulação da formação de membros acontecida durante o desenvolvimento inicial do animal. Uma importante implicação dessa idéia é o fato de a mesma programação genética estar envolvida em ambas as situações, e como os seres humanos formam membros quando embriões, a princípio, deveriam contar com a mesma programação necessária para regenerá-los quando adultos. Parece, porém, que tudo o que os cientistas precisariam fazer seria descobrir como induzir os membros amputados a formar um blastema.

Um de nós (Gardiner) – trabalhando com Tetsuya Endo, da University of California em Irvine, há poucos anos – usou uma abordagem minimalista para responder à pergunta básica sobre como criar um blastema. Em vez de pesquisar o local da amputação numa salamandra, onde um blastema se formaria naturalmente, examinamos ferimentos leves contíguos a membros da salamandra, que normalmente se recuperariam com a mera cicatrização da pele. Partimos do pressuposto de que os ferimentos eram semelhantes ao local de uma amputação de membros de mamíferos, incapazes de produzir novos membros. Se conseguíssemos fazer com que um membro completo se regenerasse onde o tipicamente esperado seria uma simples resposta de cicatrização, então conseguiríamos dissecar ainda mais o processo de regeneração.
Depois de feita uma pequena incisão na perna da salamandra, células epidêmicas migraram para cobrir e lacrar o ferimento, como aconteceria no local de uma amputação, e fibroblastos da epiderme também se movimentaram para substituir a pele ausente. E desviando um nervo, cuidadosamente, para o local de uma ferida, poderíamos induzir aqueles fibroblastos a, em vez disso, formar um blastema. Há mais de meio século Marcus Singer, da Case Western Reserve University, havia demonstrado que a resposta regeneradora requer uma inervação; e nossas experiências esclareceram que fatores desconhecidos ligados ao nervo influenciam a regeneração, alterando o comportamento dos fibroblastos locais.

No entanto, esses blastemas induzidos jamais progrediram para estágios de regeneração mais avançados para formar novos membros. Outro ingrediente seria necessário. O segredo para induzir um blastema a criar novos membros é fazer um enxerto do lado oposto do membro no local da ferida, permitindo aos fibroblastos das regiões opostas dos membros participar na resposta de cura. E, apesar de o membro acessório resultante ter crescido a partir de uma localização anormal, ele era anatomicamente normal. Assim, a receita para produzir um blastema parecia relativamente simples.

Sabíamos que a epiderme se origina em uma das três camadas das células primitivas do início da fase embrionária, a ectoderma, conhecida também por emitir sinais que controlam o crescimento exagerado de brotos de membros no embrião. As células ectodérmicas se agrupam no broto para formar uma crista ectodérmica apical (AER, na sigla em inglês), que transitoriamente produz sinais químicos que guiam a migração e a proliferação de células do broto de membros subjacentes.

Embora alguns dos sinais vitais da epiderme ainda não tenham sido identificados, há membros da família dos fatores de crescimento dos fibroblatos (FGFs, na sigla em inglês) envolvidos. A AER produz uma quantidade de FGFs que estimulam as células subjacentes do broto de membro a produzir outros FGFs, incitando o feedback de um circuito de sinalização entre a AER e as células do broto de membro que são essenciais para o desenvolvimento de um membro. Acredita-se que um circuito de feedback incitado pela AEC funcione do mesmo modo durante a regeneração de membros, e Hiroyuki Ide, da Universidade de Tohoku, no Japão, descobriu que a perda progressiva da capacidade regenerativa nos girinos está associada à incapacidade de ativar o circuito FGF. Ao tratar com FGF10 antigos membros não regenerados de girinos, ele conseguiu ativar esse circuito de sinalização e estimular a regeneração parcial dos membros amputados.

Contudo, a satisfação gerada por esse resultado foi ofuscada pelo fato de que os regenerados induzidos eram anormais, formados por partes de membros posicionados irregularmente, levantando a importante questão sobre como a regeneração é controlada para que todas as estruturas anatômicas adequadas, perdidas na amputação do membro, sejam repostas com perfeição. A verdade é que os outros agentes celulares primários, os fibroblastos, desempenham essa função.
Localização, Localização, Localização

Experiências minimalistas com membros acessórios deixaram evidente que a presença dos fibroblastos por si não é garantia de regeneração, pois os fibroblastos estão presentes no local de uma ferida comum que não dá origem a um novo membro. Os fibroblastos do lado oposto do membro é que são essenciais. Essa descoberta mostra a importância da posição celular no desencadeamento da resposta regenerativa. Num embrião a seqüência de eventos no desenvolvimento de membros sempre começa com a formação da base dos membros (do ombro ou do quadril), seguida da formação progressiva de estruturas mais distais até o final do processo com a conclusão dos dedos. Na regeneração da salamandra, na outra mão (ou pé), o local da amputação pode ser qualquer um ao longo do comprimento do membro e, seja qual for o local da ferida, apenas as partes amputadas dos membros se regeneram.

A variação na resposta mostra que as células no limite da ferida da amputação provavelmente “sabem” onde elas se encontram em relação ao membro como um todo. Essa informação sobre a posição é o que controla os processos celulares e moleculares que garantem a reposição perfeita da porção ausente dos membros, e ela deve estar gravada na atividade de vários genes. Determinar quais genes estão ativos durante esses processos contribui para esclarecer os mecanismos que controlam esse estágio de regeneração.

Embora um grande número de genes esteja encarregado de instruir as células durante o desenvolvimento embrionário – sobre seu posicionamento nos membros –, a atividade de um subgrupo de genes chamados Hox é fundamental. Na maioria dos animais as células dos brotos de membros em desenvolvimento usam o código orientador fornecido pelos genes Hox para formar o membro, mas depois, ao se diferenciarem em tecidos mais especializados, elas “esquecem” sua origem. Já os fibroblastos dos membros de uma salamandra adulta mantêm a memória de seu sistema de informação e conseguem acessar novamente o código orientador Hox no processo de regeneração de membros.

Durante a regeneração os fibroblastos carregam essa informação consigo ao migrar pela ferida para começar a formar o blastema, e, uma vez nesse local, as células se comunicam para avaliar a extensão do ferimento. O conteúdo desse diálogo é ainda um mistério, mas sabe-se que um dos seus resultados é que os membros em regeneração primeiro estabelecem seus limites, incluindo o contorno da mão ou do pé, para que as células possam usar sua informação orientadora para preencher as partes faltantes entre o plano de amputação e os dedos.

Como os membros são formados em sua maioria por músculos e ossos, também nos interessa desvendar a origem da matéria-prima para formá-los e o mecanismo que controla sua formação. Quando a resposta regenerativa é iniciada, um dos momentos iniciais vitais inclui um processo ainda pouco compreendido chamado diferenciação. O termo geralmente é empregado para descrever a reversão de uma célula de um estado adulto especializado para um estado embrionário mais primitivo que possibilita sua multiplicação, servindo como progenitora de um ou mais tipos de tecidos.
No campo da regeneração esse termo foi primeiramente usado por cientistas ao observarem ao microscópio que tecidos do coto da salamandra, em particular o músculo, aparentemente são quebrados ao dar origem a células proliferativas que formam o blastema. Sabemos que aqueles músculos associados às células não são resultantes da diferenciação do músculo, mas derivam de células-tronco, normalmente presentes no tecido muscular. Falta agora comprovar se a diferenciação realmente acontece ou não, no caso de todos os tipos de tecido de um membro em regeneração, ainda que esteja claro que a variação desse tema ocorra de fato durante a regeneração. Os fibroblastos que entram no blastema e se tornam células blastemais primitivas são capazes de se diferenciar em tecido esquelético (ossos e cartilagem), assim como voltar ao estado de fibroblasto que irá formar a trama intersticial dos membros novos, por exemplo.

Voltando a outro dos agentes celulares centrais na formação do blastema, as células epidérmicas, podemos também apontar momentos no processo de regeneração em que parece que essas células estão fazendo a transição a um estado mais embrionário. Muitos dos genes ativos na ectoderma embrionária são vitais para o desenvolvimento dos membros, incluindo o Fgf8 e o Wnt7a, mas, conforme a ectoderma do embrião se diferencia para formar as multicamadas de epiderme no adulto, esses genes são desativados. Durante a regeneração no adulto as células tronco epidérmicas que migram pelo ferimento da amputação e formam a epiderme da ferida, no início, começam a apresentar atividade genética, como a produção de proteínas queratinas cicatrizantes, que não estão diretamente relacionadas com a regeneração. Mais tarde as células epidérmicas da ferida ativam o Fgf8 e o Wnt7a, dois genes importantes do desenvolvimento. Por razões práticas, então, a definição essencial de desdiferenciação – no que se refere à epiderme e a outros tipos de células – é a reativação de genes vitais do desenvolvimento.

Portanto nossos estudos sobre as salamandras mostraram que o processo de regeneração pode ser dividido em estágios cruciais, começando com a resposta de cicatrização seguida pela formação de um blastema por células revertidas em certa medida a um estágio embrionário e, por fim, o início do programa desenvolvimental para formar o novo membro. Nossos esforços no desafio de induzir a regeneração de membros em humanos estão norteados por esses conceitos. Na verdade as descobertas mais difíceis no campo científico são aquelas ainda por vir, e regeneração de membros em humanos se encaixa perfeitamente nessa categoria, mas isso não quer dizer que os humanos não apresentem essa capacidade regenerativa natural.

O Potencial na Ponta dos Dedos

Um dos sinais mais encorajadores de que a regeneração de membros em humanos é plausível é o fato de a extremidade dos nossos dedos da mão apresentar uma capacidade de regeneração intrínseca. Esse fato foi primeiro observado entre crianças há mais de 30 anos e, desde então, há relatos de o mesmo processo ter ocorrido entre adolescentes e, até mesmo, entre adultos. Estimular a regeneração na ponta amputada de um dedo, aparentemente, requer nada mais que fazer a assepsia do ferimento e protegê-lo com um curativo. No processo natural de cura a ponta do dedo tem o seu contorno, suas digitais e sua sensibilidade restaurados, passando por vários graus de extensão. O sucesso desse tratamento conservador em amputações da extremidade dos dedos das mãos já foi relatado em publicações médicas inúmeras vezes. Curiosamente o protocolo alternativo para esse tipo de ferimento normalmente inclui suturar cirurgicamente uma tampa de pele sobre o local da amputação – “tratamento” que sabemos inibir a regeneração até mesmo numa salamandra, por interferir na formação da epiderme do ferimento. A significativa mensagem contida nesses relatórios é que os seres humanos possuem uma capacidade regenerativa inata que, infelizmente, vem sendo suprimida por alguns procedimentos médicos tradicionais.
Não é fácil pesquisar o funcionamento da regeneração natural nas extremidades dos dedos humanos, já que não podemos sair por aí amputando dedos para fazer experiências. Mas a mesma resposta tem sido encontrada por diversos cientistas entre ratos jovens e adultos. Nos últimos anos, dois de nós (Muneoka e Han) têm estudado detalhadamente a resposta regenerativa das impressões digitais. E já constatamos que há mesmo formação de epiderme na ferida após a amputação da ponta dos dedos, mas ela recobre a ferida em recuperação mais lentamente que o observado na salamandra. Constatamos ainda que, durante a recuperação da extremidade dos dedos, importantes genes embrionários ativos numa população de células não-diferenciadas estavam em proliferação no local do ferimento, indicando se tratar de células blastemais. Além disso, há indícios indiretos de que derivam de fibroblastos encontrados no tecido conectivo intersticial e na medula óssea.

A fim de explorarmos os papéis de genes específicos e de fatores de crescimento durante a resposta regenerativa de dedos de camundongos, desenvolvemos uma cultura em tecidos que serve de modelo para a regeneração de dedos de embriões desses animais. Com isso conseguimos provar que, ao retirarmos experimentalmente um fator de crescimento chamado Proteína Morfogenética Óssea 4 (BMP4, em inglês) de uma ferida de amputação em um feto, a regeneração é inibida. E mais: demonstramos que um camundongo mutante que não apresenta um gene chamado Msx1 é incapaz de regenerar a ponta dos dedos. Na ponta dos dedos em um feto o Msx1 é vital para a produção da BMP4, e foi possível restaurar a resposta regenerativa ao acrescentar a BMP4 à ferida do camundongo Msx1 deficiente, comprovando a importância da presença da BMP4 para a regeneração.

Estudos conduzidos por Cory Abate-Shen e colegas, da Robert Wood Johnson Medical School, também mostraram que a proteína codificada pelo Msx1 inibe a diferenciação em diversos tipos de célula durante o desenvolvimento embrionário. Isso somado ao controle de diferenciação sugere que a proteína desempenha um papel na resposta regenerativa, fazendo com que as células desdiferenciem. Embora o Msx1 não fique ativo nas primeiras etapas da desdiferenciação da regeneração de membros da salamandra, seu gene irmão Msx2 é um dos genes reativados durante a regeneração provavelmente desempenha uma função semelhante.
O Desafio Humano

A intenção de regenerar um membro humano pode ainda parecer longe da realidade. Contudo as constatações que acabamos de descrever nos permitem estimar com conhecimento de causa como isso se dará. Um membro amputado humano resulta numa superfície ferida complexa e extensa que secciona diversos tecidos, incluindo epiderme, derme, tecido conectivo intersticial, tecido adiposo, músculos, ossos, nervos e vascularização. Analisando esses tecidos separadamente, verificamos que a maioria deles é perfeitamente capaz de se regenerar após um ferimento de pequeno porte.

Na verdade, o único tipo tecido contido num membro que não apresenta potencial regenerativo é a derme, que é composta por uma população heterogênea de células, muitas das quais são fibroblastos – as mesmas células que desempenham papel crucial na resposta de regeneração na salamandra. Seguindo um ferimento em humanos e outros mamíferos essas células sofrem um processo denominado fibrose, que “cicatriza” feridas depositando uma trama desorganizada de matriz extracelular, que evolui formando um tecido cicatricial. A diferença mais significante entre a regeneração na salamandra e a ausência de regeneração nos mamíferos é que os fibroblastos dos mamíferos formam cicatrizes, enquanto os da salamandra, não. A resposta fibrótica nos mamíferos não apenas impede a regeneração, mas pode se transformar em um problema médico bastante sério, com potencial de comprometer progressiva e permanentemente o funcionamento de vários órgãos, como o fígado e o coração, como conseqüência de um trauma ou de uma doença.

Estudos de ferimentos profundos demonstram que ao menos duas populações de fibroblastos invadem uma ferida durante a convalescença. Algumas dessas células são fibroblastos encontrados na derme e os outros derivam de células-tronco semelhantes a fibroblastos, em circulação. Ambos os tipos são atraídos para a ferida por sinais de células imunológicas que também seguem prontamente para o local. Uma vez na ferida, os fibroblastos migram e proliferam, vindo a produzir e modificar a matriz extracelular da área. Esse processo inicial não difere muito do observado na resposta regenerativa da ferida de uma salamandra, mas os fibroblastos dos mamíferos produzem uma quantidade excessiva de matriz que anormalmente passa a ter ligações cruzadas conforme o tecido cicatricial evolui. Já os fibroblatos na salamandra param a produção da matriz tão logo a configuração original tenha sido restaurada.
CONCEITOS-CHAVE
- O padrão ideal para a regeneração de membros é a salamandra, capaz de reproduzir substitutos perfeitos para partes perdidas do seu corpo ao longo da vida. Entender como isso se dá pode abrir caminho para a regeneração de membros humanos.

- As respostas iniciais dos tecidos no local de uma amputação são semelhantes na salamandra e nos humanos. Mas, na seqüência, os tecidos no homem formam uma cicatriz, enquanto a salamandra reativa um processo de desenvolvimento embrionário que resulte em um membro novo.

- Aprender a controlar as circunstâncias da cicatrização humana para desencadear uma recuperação semelhante à da salamandra pode levar à regeneração de porções significativas do organismo. – Os editores
CURIOSIDADES
CAROL BURDSAL
Um jovem aligátor americano, fotografado na Louisiana, tem a cauda amputada regenerada.
- A cauda tem cerca do mesmo diâmetro que um membro humano, sugerindo que a capacidade para regenerar um apêndice não é limitada pelo tamanho da superfície da ferida da amputação.

- A formação de um membro novo em humanos adultos também pode não durar mais do que o fez ao crescer originalmente. Nas salamandras um fenômeno ainda mal compreendido conhecido como emparelhamento permite à regeneração do membro passar por uma fase de rápido crescimento, resultando no membro final em escala proporcional ao restante do animal.
PARA CONHECER MAIS
Members regeneration. Panagiotis A. Tsonis. Cambridge University Press,1996.

Ontogenetic decline of regenerativeability and the stimulationof humanoregenetion. David M. Gardiner, em Rejuvenation Research, vol. 8, no 3, págs. 141-153, 1o de setembro de 2005.

Members regeneration in higher vertebrates: developing a roadmap. Manjong Han et al., em Anatomical Record Part B , 1a edição, págs. 14-24, novembro de 2005.

Appendage regeneration in adult vertebrates and implications for regenerative medicine. Institute for the future. Jeremy P. Brockes e Anoop Kumar, em Science, vol. 310, págs. 1919-1923, 23 de dezembro de 2005.

Regenerative biology and medicine. David L. Stocum. Academic Press, 2006.
Ken Muneoka, Manjong Han e David M. Gardiner integram um grupo de pesquisa multiinstitucional empenhado em regenerar membros de mamíferos. Seu grupo, liderado por Muneoka, é um dos dois únicos a receber uma verba multimilionária da Agência Americana de Defesa de Projetos de Pesquisa Avançada para buscar a regeneração de membros humanos. Muneoka é professor, e Han é professor-assistente de pesquisa do departamento de biologia celular e molecular da Tulane University. Gardiner é biólogo pesquisador do departamento de biologia celular e molecular da University of Califórnia em Irvine, onde também Muneoka recebera uma bolsa de estudos para completar seu pós-doutorado. Muneoka surpreendentemente voltaria a trabalhar lá quando o furacão Katrina o forçou a realocar sua família e equipe de pesquisa de Nova Orleans para Irvine, por cinco meses.
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