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Reportagem

Vida Sintética

Biólogos criam bibliotecas de partes intercambiáveis de DNA e as montam dentro de micróbios para criar máquinas vivas programáveis

W. Wayt Gibbs
Drew Endy e sua equipe do MIT desenharam e construíram mais de 140 biotijolos guardados nestes frascos. Cada um é um pedaço de DNA que desempenha uma função característica e interage com outras partes genéticas.
"Os alunos dessa classe são felizes e estão criando coisas boas e construtivas, e não novas espécies de vírus ou armas biológicas"

A evolução é uma fonte inextingüível de criatividade: 3,6 bilhões de anos de mutações e competição deram aos seres vivos uma variedade impressionante de habilidades úteis. Mas ainda há muito espaço para aperfeiçoamentos. Determinados microrganismos são capazes de digerir o explosivo e carcinogênico TNT, por exemplo. Não seria interessante que eles brilhassem ao fazer isso, indicando a localização de minas terrestres ou a contaminação do solo? Arbustos de artemísia produzem um potente agente contra a malária, mas em quantidades tão pequenas que é caro extraí-lo. Quantos milhões de vidas poderiam ser salvas se o composto, a artemisinina, pudesse ser sintetizado a baixo custo por bactérias? E, apesar de muitos estudiosos de câncer estarem dispostos a dar um olho em troca de uma célula com um contador confiável que mostrasse quantas vezes ela se dividiu, a Natureza parece não ter achado tal invento necessário.

Pode parecer uma simples questão de engenharia genética reprogramar células para que brilhem na presença de uma toxina, manufaturar um remédio complicado ou monitorar a idade das células. Mas a criação de dispositivos biológicos como esses está longe de ser fácil. Os biólogos vêm transplantando genes de uma espécie para outra há 30 anos, e mesmo assim a engenharia genética ainda tem muito mais de artesanato que de engenharia.

"Digamos que eu queira modificar uma planta para que ela mude de cor na presença do TNT", propõe Drew Endy, biólogo do Instituto de Tecnologia de Massachusetts. "Posso começar manipulando os sistemas genéticos da planta e, se tiver sorte, depois de um ano ou dois obterei um \\`dispositivo\\` - um sistema. Mas isso não vai me ajudar a criar uma célula que circule e coma as placas das paredes das artérias, ou a fabricar uma microlente. A prática atual produz basicamente obras de arte."

Endy faz parte de um grupo crescente de cientistas que se destacaram nos últimos anos por reforçar as fundações da engenharia genética com o que chamam de biologia sintética. Eles estão projetando e construindo sistemas vivos que ajam de modo previsível, que usem partes intercambiáveis e que, em alguns casos, operem com um código genético expandido, que lhes permita fazer coisas impossíveis a qualquer outro organismo natural.
Esse campo científico embrionário tem três objetivos principais: um, aprender sobre a vida através de sua construção, em vez de sua destruição. Dois, fazer com que a engenharia genética faça jus ao nome - uma disciplina que se desenvolva constantemente pela padronização de suas criações e sua recombinação para produzir novos e mais sofisticados sistemas. E três, expandir os limites de seres vivos e máquinas até que ambos se unam para produzir organismos realmente programáveis. Microrganismos que detectem TNT e que produzam artemisinina já parecem possíveis. Os protótipos atuais são relativamente primitivos, mas a visão é grandiosa: pense nisso como Vida, versão 2.0.

As raízes da biologia sintética remetem a 15 anos atrás, ao trabalho pioneiro de Steven A. Benner e Peter G. Schultz. Em 1989, Benner liderou uma equipe do ETH de Zurique que criou um DNA com duas "letras" genéticas artificiais, além das quatro que aparecem na vida tal como a conhecemos. Desde então, ele e outros criaram diferentes variedades de DNA aprimorado. Até agora, ninguém conseguiu criar genes funcionais - que sejam transcritos para RNA e depois traduzidos para a forma de proteína - a partir do DNA alterado. No ano passado, no entanto, o grupo de Schultz, do Instituto de Pesquisa Scripps, desenvolveu células (contendo DNA normal) capazes de gerar aminoácidos não-naturais e reuni-los para formar novas proteínas (ver quadro na pág. 66).

Benner e outros biólogos sintéticos da "velha geração" encaram a genética artificial como um meio de explorar perguntas básicas; como a vida surgiu na Terra e que formas ela pode assumir em outros locais do Universo. Muito interessante, mas o que vem mesmo dando destaque à biologia sintética ultimamente é a promessa de que se torne um método de projetar e construir máquinas que atuem dentro das células. Dois dispositivos assim, descritos ao mesmo tempo em 2000, inspiraram trabalhos subsequentes.

Os dois dispositivos foram construídos pela inserção de seqüências selecionadas de DNA na Escherichia coli, uma bactéria normalmente inofensiva comum no intestino humano. Os dois, no entanto, tinham funções muito diferentes. Michael Elowitz e Stanislaus Leibler, então na Universidade de Princeton, organizaram três genes interagentes de modo a fazer a E. coli piscar como luzinhas de Natal microscópicas . Enquanto isso, James J. Collins, Charles R. Cantor e Timothy S. Gardner, da Universidade de Boston, construíram um interruptor genético. Uma retroalimentação negativa - dois genes que interferem entre si - faz o interruptor se mover entre dois estados estáveis. Isso fornece a cada bactéria modificada uma memória digital rudimentar.
Para os biólogos com espírito de engenheiros, essas experiências foram estimulantes, mas também frustrantes. Demorou quase um ano para criar o interruptor, e cerca do dobro disso para produzir os micróbios que piscam. E ninguém via uma possível ligação entre os dois dispositivos, para fazer, por exemplo, bactérias fluorescentes que pudessem ser ligadas e desligadas.

"Gostaríamos de ser capazes de montar sistemas a partir de peças bem descritas e obedientes", diz Endy. "Dessa maneira, se alguém no futuro me pedir para construir um organismo que, digamos, conte até 3.000 e vire à esquerda, poderei escolher as partes necessárias na prateleira, uni-las e prever como elas vão atuar." Há quatro anos, partes como essas não passavam de um sonho. Hoje elas enchem uma caixa na mesa de Endy.

Construindo com Biotijolos

"AQUI ESTÃO PARTES GENÉTICAS", DIZ ENDY, segurando um recipiente contendo mais de 50 frascos cheios de um líquido transparente e viscoso. "Cada um desses frascos contém cópias de uma seção diferente de DNA, que desempenhe uma função sozinha ou que possa ser usada por uma célula para produzir uma proteína que faça algo útil. O importante aqui é que cada parte genética foi cuidadosamente projetada para interagir bem com as outras partes, em dois níveis." No nível mecânico, os biotijolos (BioBricks, como o grupo do MIT chama as partes) podem ser fabricados e armazenados independentemente, e depois reunidos para formar pedaços maiores de DNA. E, no nível funcional, cada parte envia e recebe sinais bioquímicos padronizados. Desse modo, um cientista pode mudar o comportamento de uma "construção" apenas pela substituição de uma das partes em determinado local.

"Componentes intercambiáveis são algo inerente a outros tipos de engenharia", ressalta Endy, mas a engenharia genética está somente começando a tirar proveito do conceito. Uma de suas vantagens é a abstração. Assim como engenheiros elétricos não precisam saber o que há dentro de um condensador para usá-lo num circuito, os engenheiros biológicos adorariam poder usar um interruptor genético sem ter a menor idéia de seus coeficientes ou da aparência bioquímica dos promotores, repressores, ativadores, indutores e outros elementos genéticos que o fazem funcionar.
Um dos frascos da caixa de Endy, por exemplo, contém um biotijolo inversor (também chamado operador NOT). Quando seu sinal de entrada é alto, seu sinal de saída é baixo, e vice-versa. Outro biotijolo desempenha a função booliana AND, só emitindo um sinal de saída quando recebe níveis altos em sua entrada. Como as duas partes trabalham com sinais compatíveis, sua conexão gera um operador NAND (NOT AND). Praticamente qualquer computação binária pode ser obtida com um número suficiente de operadores NAND.

Além da abstração, a padronização das partes oferece outra vantagem importante: a possibilidade de projetar sistemas genéticos funcionais sem saber exatamente como construí-los. No início do ano passado, uma classe de 16 alunos conseguiu, em um mês, especificar quatro programas genéticos para fazer grupos de células de E. coli piscar ao mesmo tempo, como fazem às vezes os vagalumes. Os estudantes não sabiam como criar seqüências de DNA, e nem precisavam saber. Endy contratou uma empresa que sintetiza DNA para manufaturar as 58 partes requeridas pelos projetos. Esses novos biotijolos foram então adicionados ao Registro de Partes Biológicas Padrão do MIT. Esse banco de dados online lista hoje mais de 140 partes, e o número aumenta mês a mês.

Seqüestrando Células

Por mais útil que seja aplicar as lições de outros campos da engenharia à genética, depois de certo ponto a analogia desmorona. Máquinas elétricas e mecânicas normalmente são independentes. Isso também é verdade para alguns dispositivos genéticos: no início deste ano, por exemplo, Milan Stojanovic, da Universidade de Colúmbia, conseguiu criar biomoléculas semelhantes ao DNA que são uma versão química de jogo-da-velha. Mas os biólogos sintéticos estão mais interessados em construir dispositivos genéticos dentro de células vivas, para que os sistemas possam se mover, se reproduzir e interagir com o mundo real. Do ponto de vista da célula, o dispositivo sintético dentro dela é um parasita. A célula lhe fornece energia, matéria-prima e a infra-estrutura bioquímica que decodifica o DNA para RNA-mensageiro e depois para proteína.

A presença da célula hospedeira, porém, acrescenta grande complexidade à questão. Biólogos investiram anos de trabalho em modelos computacionais da E. coli e de outros organismos unicelulares. Mesmo assim, diz Ron Weiss, de Princeton, "se você me der a seqüência de DNA de seu sistema genético, não posso dizer o que a bactéria vai fazer com ele". Na realidade, lembra Endy, "metade das 60 partes que projetamos em 2003 não puderam ser inicialmente sintetizadas porque elas matavam as células que as estavam copiando. Tivemos de descobrir um meio de reduzir o esforço imposto às células pelo transporte e pela replicação do DNA projetado". (No fim, 58 das 60 partes foram produzidas com sucesso.)
Uma forma de enfrentar a complexidade trazida pelo genoma nativo das células é evitá-la: o dispositivo genético pode ser isolado dentro de seu próprio loop (alça) de DNA, separado do cromossomo do organismo. A separação física é só uma meia-solução, porque não há fios nas células. A vida funciona em "rede líquida", com sinais direcionadores de proteínas flutuando de um local para outro. "Portanto, se eu tiver aqui um inversor feito de proteínas e DNA", explica Endy, "um sinal direcionador de proteína destinado a essa parte também vai atuar em qualquer outro inversor como esse em qualquer outro lugar da célula", independentemente de ele estar dentro do loop artificial ou no cromossomo natural.

Um modo de evitar o cruzamento de sinais é tentar não usar a mesma parte duas vezes. Weiss usou essa abordagem ao construir o circuito genético "Cachinhos Dourados", que se ilumina quando há a presença de determinada substância química, mas apenas quando sua concentração não for nem muito alta nem muito baixa (ver ilustração na pág. oposta). Há quatro inversores dentro de suas várias partes, e cada inversor reage a um sinal. A questão é que essa estratégia torna muito mais difícil projetar partes que sejam realmente intercambiáveis e possam ser rearrumadas.

Endy está testando outra solução, que pode se mostrar mais eficiente para alguns sistemas. "Nosso inversor usa os mesmos componentes [utilizados por Weiss], mas organizados de modo diferente", diz Endy. "A informação não é uma proteína, mas uma taxa, especificamente a taxa de transcrição do gene. O inversor responde a quantos RNAs-mensageiros são produzidos por segundo. Ele produz uma proteína, e essa proteína determina a taxa de transcrição [ao ativar um segundo gene]. Portanto, eu mando Tips [transcrições por segundo] e obtenho TIPS. É a moeda comum, como a corrente de um circuito elétrico." Na teoria, o inversor pode ser removido e substituído por qualquer outro biotijolo que processe TIPS. E os sinais de TIPS são localizados, por isso a mesma parte pode ser usada em vários locais de um circuito sem interferência.

A técnica TIPS vai ser testada por um novo conjunto de sistemas genéticos projetados por alunos que fizeram um curso de inverno no MIT, em janeiro. A meta neste ano era reprogramar células para que elas trabalhassem em conjunto de modo a formar padrões, como uma estampa de bolinhas, numa placa de laboratório. Para isso, as células precisam se comunicar através da secreção e da percepção de nutrientes químicos.
"Os sistemas deste ano têm o dobro do tamanho dos projetos de 2003", diz Endy. Foram necessários 13 meses para construir os projetos da E. coli que pisca e inseri-los em células. Mas neste ano o estoque de biotijolos é maior, a velocidade da síntese de DNA aumentou e os engenheiros têm mais experiência na montagem de circuitos. Por isso Endy espera que os projetos de 2004 estejam prontos para teste em cinco meses, a tempo de ser exibidos na primeira conferência sobre biologia sintética, marcada para junho.
Reescrevendo o Livro da Vida

Os cientistas que forem á conferência vão sem dúvida chorar as pitangas sobre a dificuldade inerente em projetar um pedaço de DNA relativamente pequeno que funcione confiavelmente dentro de uma célula em constante mudança. Máquinas vivas se reproduzem, mas também sofrem mutações.

"A replicação está longe de ser perfeita. Já construímos circuitos e os vimos sofrer mutação em metade das células num espaço de cinco horas", conta Weiss. "Quanto maior for o circuito, mais rápido tende a sofrer mutação." Weiss e Frances Arnold, do Caltech (Instituto de Tecnologia da Califórnia), desenvolveram circuitos de desempenho aprimorado ao observar várias rodadas de mutação e selecionar as células mais aptas a realizar a tarefa desejada. Sem supervisão, a evolução tende a destruir as máquinas genéticas.

"Eu gostaria de produzir um dispositivo geneticamente codificado que aceitasse um sinal de entrada e simplesmente contasse: 1, 2, 3,... até 256", sugere Endy. "Isso não é muito mais complexo do que o que construímos agora, e nos permitiria detectar com rapidez e precisão certos tipos de células que perderam o controle sobre sua reprodução e se tornaram cancerosas. Mas como faço para projetar um mostrador que continue intato enquanto a máquina faz cópias de si mesma com erros? Não faço idéia. Talvez tenhamos de incorporar a redundância - ou talvez precisemos fazer com que a função do marcador seja de algum modo positiva para a célula."

Ou quem sabe os engenheiros vão ter de entender melhor como formas simples de vida, como os vírus, resolveram o problema da persistência. Aqui, também, a biologia sintética pode ajudar. Em novembro passado, Hamilton O. Smith e J. Craig Venter anunciaram que seu grupo, no Instituto para Alternativas Biológicas de Energia, havia recriado, a partir do nada e em apenas duas semanas, um bacteriófago (vírus que infecta bactérias) chamado phiX174. O vírus sintético, disse Venter, tem os mesmos 5.386 pares base de DNA que a forma natural e é tão ativo quanto ela.

"A síntese de um cromossomo grande está agora claramente ao nosso alcance", disse Venter, que durante muitos anos chefiou um projeto para identificar o conjunto mínimo de genes necessários para a sobrevivência da bactéria Mycoplasma genitalium. "O que não sabemos é se podemos inserir esse cromossomo em uma célula e transformar o sistema operacional da célula para eliminar gradualmente o novo cromossomo. Vamos ter de compreender a vida em seu nível mais básico, e estamos longe de fazer isso."
A recriação letra por letra de um vírus não revela muito sobre ele. Mas e se o genoma fosse dissecado em seus genes constituintes e depois metodicamente remontado de modo que fizesse sentido para os engenheiros humanos? Isso é o que Endy e seus colegas estão fazendo com o bacteriófago T7. "Reconstruímos o T7 - não só o ressintetizamos, mas fizemos uma reengenharia no genoma e o sintetizamos", conta Endy.

Os cientistas estão separando genes que se sobrepõem, cortando redundâncias etc. O grupo completou até agora cerca de 11,5 quilobases e pretende concluir os 30 mil pares base restantes até o fim de 2004.
Até hoje, os biólogos sintéticos construíram sistemas genéticos vivos como experiências e demonstrações. Mas já há laboratórios de pesquisa trabalhando em suas aplicações. Martin Fussenegger e seus colegas do ETH de Zurique foram promovidos da bactéria aos mamíferos. No ano passado, obtiveram células de hamster com redes de genes que realizam uma espécie de controle de volume: a adição de pequenas quantidades de diferentes antibióticos fazia a emissão dos genes sintéticos variar entre baixa, média e alta. Esse tipo de controle da expressão de genes pode se revelar bem útil nas terapias genéticas e na fabricação de proteínas farmacêuticas.

Primeiros Protótipos

As primeiras ultilizações das máquinas vivas serão provavelmente em tarefas que requeiram uma química sofisticada, como a detecção de toxinas ou a sintetização de drogas. No ano passado, Homme Hellinga, da Universidade Duke, inventou um meio de redesenhar proteínas sensoras naturais da E. coli de modo que elas se ligassem ao TNT ou a qualquer outro composto de interesse em vez de a seus alvos normais. Weiss disse que ele e Hellinga discutem unir seu circuito "Cachinhos Dourados" com o sensor de Hellinga para produzir detectores de minas terrestres.

Jay Keasling, que fundou recentemente um departamento de biologia sintética no Laboratório Nacional Lawrence Berkeley (LBNL), conta que seu grupo conseguiu colocar uma grande rede de genes de artemísia e de levedura dentro da E. coli. O circuito permite à bactéria fabricar um antecedente químico da artemisinina, uma droga antimalárica cujo custo de produção é hoje muito alto para os países em desenvolvimento que mais precisam dela.

Keasling diz que, em três anos de trabalho, a produção cresceu 1 milhão de vezes. Se as safras forem multiplicadas outras 25 ou 50 vezes, "seremos capazes de produzir para o Terceiro Mundo o coquetel duplo de drogas baseadas na artemisinina por cerca de um décimo do preço atual". Com alterações relativamente simples, bactérias modificadas podem passar a produzir as caras substâncias químicas usadas em perfumes, em essências de sabor e no medicamento contra o câncer Taxol.
Outros cientistas do LBNL estão usando a E. coli para ajudar na eliminação de lixo nuclear, assim como de armas químicas e biológicas. Uma equipe está modificando o sentido do "olfato" da bactéria para que ela nade em direção a um agente nervoso, como o VX, e o digira. "Modificamos a E. coli e a Pseudomonas aeruginosa para que elas depositem metais pesados, urânio e plutônio na parede celular", diz Keasling. "Quando as células acumulam os metais, elas se decantam da solução, deixando a água limpa."

Objetivos louváveis, todos esses. Mas você não é o único a se sentir um tanto desconfortável ao pensar em alunos de graduação criando novos tipos de germes, em laboratórios privados sintetizando vírus e em cientistas publicando trabalhos sobre como usar bactérias para coletar plutônio.

Em 1975, biólogos importantes pediram a interrupção do uso da tecnologia do DNA recombinante e organizaram uma conferência em Asilomar, na Califórnia, para discutir como regulamentar seu uso. O autopoliciamento parece funcionar: nunca houve um grande acidente com organismos geneticamente modificados. "Mas três coisas mudaram no panorama recente", afirma Endy. "Primeiro, agora qualquer um pode baixar na Internet a seqüência de DNA para os genes da toxina do antraz ou de outras coisas ruins. Em segundo lugar, qualquer um pode comprar DNA sintético de empresas estrangeiras. E, em terceiro, estamos agora mais preocupados com o mau uso intencional."

Como a sociedade pode combater os riscos de uma nova tecnologia sem se privar de todos os seus benefícios? "A Internet continua funcionando porque há mais gente querendo sua permanência que gente querendo seu fim", sugere Endy. Ele mostra uma foto no ano passado. "Olhe. Eles são felizes e estão criando coisas boas e construtivas, e não novas espécies de vírus ou armas biológicas. No fim, criar uma sociedade capaz de usar a tecnologia construtivamente é um meio de lidar com os riscos dessa tecnologia."

Mas ele também acha que faz sentido realizar uma conferência para discutir os problemas potenciais. "Acredito que seria totalmente adequado realizar uma reunião como a de Asilomar para discutir a situação atual e futura da tecnologia biológica", diz. Em junho, quando líderes no assunto se encontrarem para compartilhar suas idéias mais recentes sobre o que já é possível criar, talvez reservem parte do tempo para pensar sobre o que não deve ser criado.